生物化学实验讲解微课

同学们，大家好！欢迎来到生物化学实验课堂，今天，我们来学习RNA的提取和鉴定。我们将以酵母为材料，带同学们掌握从细胞裂解到RNA组分鉴定的全流程操作，包括酵母细胞破碎、有机溶剂抽提、RNA沉淀等关键技术，以及通过颜色反应验证核糖、嘌呤碱和磷酸的存在，深入理解核酸的理化特性。

酵母因其RNA含量高（2.67%～10.0%），被选作提取高质量RNA的理想材料。本实验采用稀碱法提取酵母RNA。利用稀碱溶液裂解酵母细胞，使RNA释放并溶解于碱液中，通过离心去除蛋白质和菌体后，得到含有RNA的上清液。在其中加入酸性乙醇，结合离心技术使RNA沉淀，再用高浓度乙醇洗去RNA中的蛋白杂质，即可得到RNA制品。接下来，通过硫酸并煮沸的方法水解RNA，得到RNA水解液。现在请你按下暂停键，思考一下，RNA水解后的产物有哪些呢？让我们通过实验验证一下吧！在水解液中加入硝酸银和过量浓氨水，二者反应生成氢氧化二氨合银，该产物可与嘌呤碱发生化学反应，生成棕色的嘌呤盐基银，通过此颜色可判定前期RNA组分中存在嘌呤碱。

核糖在浓盐酸催化下可以脱水生成糠醛，在3价铁离子催化下，糠醛与苔黑酚反应显墨绿色，此颜色的出现可以鉴定核糖的存在。磷酸可与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，此物可被抗坏血酸还原成钼蓝，产物显蓝色，据此判定初反应物中是否存在磷酸根。

下面我们来看用到的试剂，氢氧化钠溶液用于裂解酵母细胞并溶解RNA；酸性乙醇溶液由浓盐酸和无水乙醇以1：100的体积比配置而成，用于沉淀RNA；95%乙醇用于洗涤RNA；1.5mol/L硫酸溶液用于水解RNA；浓氨水和硝酸银用于鉴定嘌呤碱；三氯化铁浓盐酸由10％ 三氯化铁与浓盐酸以1：200 的体积比配置而成，苔黑酚乙醇溶液是将苔黑酚溶于95％乙醇配置而成，以上两种试剂用于鉴定核糖；定磷试剂由17％的硫酸溶液、2.5％钼酸铵溶液、10％抗坏血酸溶液、蒸馏水以1 : 1 : 1 : 2 的比例配置而成，用于鉴定磷酸基团。

现在进入操作环节，首先是裂解细胞使RNA释放。取15g酵母片于90 mL 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液中进行研磨。由于酵母细胞壁较厚，为使RNA充分释放，请注意一定研磨充分。将研磨好的悬浮液转移到锥形瓶，沸水浴30分钟，此时RNA已经释放到悬浮液中，待冷却后，即可分离RNA。此时，将悬浮液转入离心瓶，3000 r/min离心10分钟，那么上清液中即含有我们所需要的RNA。接下来开始沉淀RNA，将上清液倒入酸性乙醇溶液中，并充分搅拌，3000 r/min离心3分钟，此时沉淀即为RNA初制品。弃上清，用95％乙醇20 mL洗涤沉淀，3000 r/min离心3分钟，再次弃上清，用95％乙醇20 mL重复洗涤沉淀一次，并转移至布氏漏斗中进行抽滤。所得即为酵母细胞的RNA。需要注意的是，此法易导致RNA降解，仅适用于组分鉴定，不保留生物活性。那么，请思考本实验中导致RNA降解的因素有哪些？RNA降解与水解的区别是什么？好了，下面我们将要水解提取的RNA制品，首先取200 mg RNA制品，加入1.5 mol/L硫酸溶液10 mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液，如果前面操作得当，那么此时RNA已经完全水解，待冷却，即可开始鉴定其组分。取3支试管，做好标记（如A、B、C），各加入1mL上述RNA水解液，再于A管加入1 mL 0.1mol/L硝酸银溶液和过量（≥21.5微升）浓氨水（14mol/L），B管加入2 mL 三氯化铁浓盐酸溶液和0.2 mL 苔黑酚乙醇溶液，C管加入1mL 定磷试剂，至于沸水浴中加热10min，观察颜色变化，得出结论。

实验过程中需要注意的是，浓氨水有毒，对眼、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，且有燃烧爆炸危险，应注意通风，戴口罩，避免明火，避免直接接触，其他试剂如硫酸具有腐蚀性，应小心操作，以上试剂若不慎沾到皮肤应立即用清水冲洗。95％乙醇易挥发，每次取用完务必及时拧紧盖子。水浴锅用完应及时断电，排水。使用离心机务必保证配平。研磨酵母一定要彻底、充分，否则RNA提取量会大幅降低。

好了，同学们，今天的课程就到这里，我们下节课再见。